Page 8 Volume 16 - N.4 - 2008

C. Morgado, et al.: Hiperactividade Neuronal na Neuropatia Diabética
estão associadas a diminuição na expressão microscópica e foram captadas imagens, atra-
de KCC2 nas lâminas superficiais do corno vés de câmara digital de alta resolução acopla-
dorsal da medula espinhal, o que parece in- da a microscópio de luz. Os restantes animais
verter a acção inibitória do GABA 9,20,36 . O pre- foram decapitados e o material foi imediatamen-
sente trabalho teve como objectivo avaliar a te colhido e processado por western blotting
expressão do GABA, da enzima de síntese – para quantificação do KCC2.
GAD e do KCC2 na medula espinhal de ratos Procedeu-se à quantificação densitométrica
com neuropatia diabética. da imunorreacção nas lâminas I, II e III do corno
dorsal da medula espinhal e das bandas resul-
Material e métodos tantes do western blotting para KCC2 e α-tubulina
Animais (controlo interno do western blotting), usando-se
o programa NIH image 1.52 (Instituto Nacional
Este estudo foi desenvolvido de acordo com de Saúde, EUA). As densidades ópticas quanti-
as directrizes éticas para o estudo da dor em ficadas nas bandas de KCC2 foram normaliza-
animais conscientes e com a Directiva das para os valores apresentados nas bandas
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86/609/EEC do Conselho da Comunidade Eu- de α-tubulina, calculando-se a razão das inten-
ropeia. sidades KCC2/α-tubulina.
A diabetes foi induzida em ratos Wistar ma-
chos adultos (Charles River; França, peso: Anticorpos e reagentes
250-350 g) por administração intraperitoneal
de 0,3 ml de STZ (60 mg/kg; Sigma-Aldrich, Utilizaram-se os seguintes anticorpos primá-
St. Louis, EUA). Estes animais constituíram o rios nas diluições mencionadas: anti-GABA pro-
grupo STZ (n = 9). Os animais-controlo recebe- duzido em cobaio (1:4.000; Abcam), anti-GAD
ram igual volume de soro (grupo controlo; n = 9). 65/67 (1:2.000; Biotrend), anti-KCC2 (1:20.000;
A glicemia foi avaliada três dias mais tarde, numa Sigma-Aldrich), ambos produzidos em coelho,
amostra de sangue colhida por punção da veia e anti-α-tubulina produzido em ratinho (1:5.000,
da cauda, utilizando-se um aparelho comercial Sigma-Aldrich). Os anticorpos secundários fo-
(Accu Chek Sensor Comfort; Roche Diagnos- ram os seguintes: imunoglobulina cabra anti-
tics). Apenas os ratos com glicemia superior a cobaio para o GABA (1:200, Laboratórios Vec-
300 mg/dl foram considerados diabéticos e in- tor) e porco anti-coelho para a GAD 65/67 e o
cluídos no estudo. KCC2 (1:200, Dako) e imunoglobulina de rati-
nho anti-coelho conjugada com uma peroxida-
se de horseradish utilizada no western blotting
Avaliação comportamental das respostas à dor (1:3.000, Laboratórios Vector). Utilizou-se um
Os animais foram avaliados, uma vez por reagente de revelação por quimioluminescên-
semana, para confirmar o desenvolvimento de cia para western blotting (Pierce Biotechnolo-
sinais comportamentais da neuropatia diabéti- gy), conjugado avidina-biotina (1:200, Kit ABC
ca. As respostas comportamentais a estímulos Elite, Laboratórios Vector) e a diaminobenzidina
mecânicos e térmicos foram avaliadas pelo (DAB, Sigma-Aldrich) nas reacções de imuno-
teste de pressão da pata e pelo teste de flexão histoquímica.
da cauda, respectivamente, conforme previa-
mente descrito . Os limiares de dor mecânica Análise estatística
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e térmica foram determinados pela média de
três avaliações consecutivas com cinco minu- Utilizou-se o teste não-paramétrico de
tos de intervalo. Mann-Whitney para comparar as densidades
ópticas nas diferentes lâminas do corno dor-
Imuno-histoquímica e western blotting sal da medula espinhal e os valores da razão
KCC2/α-tubulina. Os resultados são apresen-
Quatro semanas após injecção de STZ ou tados como média ± erro padrão da média
soro, cinco animais de cada grupo foram sacri- (EPM).
ficados por perfusão transcardíaca e fixados em
paraformaldeído a 4% em 0,1 M de solução tam-
pão fosfatos, pH 7,4. Removeram-se os segmen- Resultados
tos espinhais L2-L3 e fizeram-se cortes coronais Três dias após a injecção com STZ, os ratos
da medula, a 40 μm de espessura, em micróto- desenvolveram hiperglicemia, condição man-
mo de congelação. Seguiu-se o processamento tida até ao final do estudo (Quadro 1). O peso
por reacção imuno-histoquímica para detecção do ratos STZ às quatro semanas após injecção
de GABA, GAD e KCC2 pelo método de avidina- era significativamente inferior ao dos ratos-
biotina-peroxidase. Alguns cortes foram ainda controlo. Os ratos STZ apresentaram uma re-
corados com formol-tionina para delimitação ci- dução progressiva do limiar de dor mecânica,
toarquitectónica das lâminas da medula espi- sendo mais acentuada às quatro semanas,
nhal, conforme descrito anteriormente . Os com aumento no limiar de dor térmica eviden- DOR
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cortes processados por imuno-histoquímica fo- ciado às duas semanas e inalterado até ao
ram devidamente preparados para visualização final do estudo (Quadro 1). Estes dados estão 7