Page 8 Volume 11, Número 2, 2003

Osório LA, et al.: Estudo de expressão do Drg11 nas regiões cranianas durante o desenvolvimento das vias nociceptivas Dor (2003) 11
conexões entre os neurónios nociceptivos aferen- durante 4 h a 56 ºC. De seguida, os cortes
tes primários e os seus alvos nas lâminas super- foram incubados com as sondas RNA em tam-
ficiais do corno dorsal (Chen, et al., 2001). O pão de hibridação numa diluição de 1µg/ml
estudo dos genes que actuam a montante do durante 16 h a 56 ºC. Após a ligação, as prepa-
Drg11 sugere que esta proteína seja regulada de rações foram lavadas, pré-incubadas durante 1 h
forma distinta nos gânglios raquidianos e na me- com 20% de soro em PBT, e incubadas 16 h, a
dula espinal, apontando assim para a possibilida- 4 ºC, com um anticorpo antidigoxigenina conju-
de de existirem diferentes modos de acção do gado com a fosfatase alcalina. A revelação foi
Drg11, conforme a especificidade do local de efectuada com os cromogénicos NBT e BCIP.
expressão (Chen, et al., 2001; Quian, et al., 2002).
Neste trabalho procedeu-se identificar, por Coloração pelo formol-tionina
recurso à técnica de hibridação in situ, os
vários locais de expressão do Drg11, com par- Os cortes foram corados por formol-tionina
ticularmente realce para a região craniana. de acordo com procedimentos padrão (Donovi-
ck, 1974). Brevemente, as preparações foram Figura 1. Expressão do Drg11 na medula espinal e nos gânglios raquidianos. Hibridação in situ com uma sonda
ribonucleica de Drg11 antisense (A) e sense (B) a partir de cortes transversais da medula lombar de embriões de
Materiais e métodos incubadas 5 min com a solução de acetona ratinho no dia E14.5. Em (C) um corte adjacente corado por formol-tionina. As setas indicam expressão de Drg11
ácida (80% de acetona em ácido acético), lava-
Extracção de RNA total das com água e coradas com 0,1% de tionina nos gânglios raquidianos (DRG) e nas lâminas superficiais do corno dorsal da medula espinal.
Quatro ratinhos, com uma semana de idade, durante 7 min. A descoloração foi efectuada
foram sacrificados de acordo com os padrões com uma solução contendo 66% de propanol e
éticos vigentes (Zimmermann, 1983). Os res- 3% de ácido acético.
pectivos gânglios raquidianos foram recolhidos
e utilizados para a extracção de RNA total Resultados
através do método do tiocianeto de guanidina Para proceder à hibridação in situ, foi sinteti-
utilizando-se para este fim o produto RNA- zada uma sonda ribonucleica conforme descri-
gents®‚ Total RNA Isolation System (Promega), to nos materiais e métodos. A especificidade
de acordo com as instruções do fabricante. desta sonda foi testada por controlo negativo
com uma sonda RNA sense produzida para o
Síntese das sondas ribonucleicas efeito. As experiências de hibridação in situ
O cDNA correspondente aos nucleótidos foram efectuadas em secções de tecido embri-
327-807 da sequência de Drg11 de ratinho onário. De acordo com dados recentes (Chen,
(GenBank AK039633) foi amplificado por RT- et al., 2001; Quian, et al., 2002), o Drg11 ex-
PCR a partir de RNA total de gânglios raquidi- pressa-se inicialmente nos gânglios raquidia-
anos, utilizando-se para este efeito os primers nos de embriões de 11,5 dias de idade (E11.5),
5´-aaggaacccatggcagag-3´ e 5´-tcatacactcttc- seguindo-se, um dia mais tarde, expressão no
tctccctcgc-3´. O fragmento obtido foi purificado corno dorsal da medula espinal. Este padrão Figura 2. Expressão do Drg11 nos gânglios trigeminais. A) Hibridação in situ com uma sonda ribonucleica de Drg11
em secções coronais da região craniana de embriões de ratinho no dia E14.5. B) Coloração por formol-tionina de
e clonado, por TA cloning, no plasmídio pCR2.1 de expressão mantem-se em idades embrioná- uma secção adjacente (B). As setas indicam a localização dos gânglios trigeminais.
(Invitrogen). Os plasmídios contendo a inserção rias mais tardias (Fig. 1a), e durante algumas
foram purificados e utilizados para a síntese de semanas pós-natais (dados não apresentados).
sondas ribonucleicas antisense (complementar ao A expressão detectada é específica uma vez Discussão com origem nos gânglios trigeminais projectam
mRNA de Drg11) e sense (controlo negativo), que não se observa nenhuma marcação com a para as lâminas superficiais do complexo trige-
marcadas com digoxigenina, utilizando-se para sonda ribonucleica controlo (Fig. 1b). Em colo- O Drg11 é um dos factores de transcrição minal (Sewards, et al., 2002). Assim, os dados
este fim o produto DIG DNA Labeling Kit (Roche). rações citoarquitectónicas pelo formol-tionina essenciais ao desenvolvimento das vias noci- disponíveis sublinham o papel do Drg11 na
(Fig. 1c), confirma-se a expressão do Drg11 ceptivas (Chen, et al., 2001; Quian, et al., 2002).
nas lâminas superficiais do corno dorsal da Actualmente, é o único em que o silenciamento conexão entre o primeiro e o segundo neurónio
Hibridação in situ medula espinal, região que recebe os aferentes do respectivo gene provoca alterações exclusi- da via nociceptiva ao longo de todo o eixo
Para a hibridação in situ, os tecidos embri- primários nociceptivos vindos do gânglio raqui- vamente no sistema nociceptivo, nomeadamen- rostrocaudal. Resta esclarescer, por meio de
onários de ratinhos de várias idades foram diano. te deficiências na penetração das projecções técnicas mais sensíveis, se o Drg11 se expres-
fixados em 4% paraformaldeído durante 12 h Em secções coronais da porção craniana de dos neurónios nociceptivos dos gânglios raqui- sa também em zonas ditas de terceira ordem
a 4 ºC e crioprotegidos numa solução de 30% embriões de ratinho, detectou-se marcação nos dianos nas lâminas superficiais do corno dorsal para o processamento nociceptivo, tal como o
(p/v) de sacarose em tampão fosfato até serem gânglios trigeminais (Fig. 2a), conforme é reve- da medula espinal (Chen, et al., 2001). Contu- tálamo. A verificar-se, estes resultados apoiam a
processados. O material foi então criosecciona- lado por coloração de cortes adjacentes com do, muito pouco se sabe sobre o modo de hipótese do Drg11 estar implicado no estabeleci-
do, em cortes com espessura de 10 µm. Após formol-tionina (Fig. 2b), e nas lâminas superfici- acção do Drg11. Neste estudo demonstra-se mento das vias nociceptivas na sua globalidade.
montagem em lâminas, os cortes foram fixados ais dos núcleos trigeminais (Fig. 3a, b). O com- que o Drg11 se expressa não apenas nos
em 4% paraformaldeído durante 20 min, lavados plexo trigeminal sensitivo divide-se em dois gânglios raquidianos e nas lâminas superficiais Agradecimentos
em PBS e tratados com proteinase K (0,4 µg/ml) componentes, as porções espinal e principal do corno dorsal da medula espinal, mas tam- Este trabalho foi financiado através- do pro-
durante 7 min. Após lavagem com PBS, os (Sewards, et al., 2002). De modo a possibilitar bém nas regiões cranianas funcionalmente equi- jecto FCTSapiens 32257/99.
cortes foram novamente fixados em 4% parafor- uma visualização mais clara das diversas por- valentes, nomeadamente os gânglios trigemi-
maldeído durante 15 min, lavados com PBS e ções do complexo trigeminal, foram utilizados nais e as porções espinal e principal. Bibliografia
incubados com o tampão de hibridação (50% cortes transversais. Foi detectada expressão do O complexo trigeminal sensitivo recebe afe-
formamida, 5X SSC, 0,3 mg/ml tRNA, 100 µg/ml Drg11 nas porções espinal e principal do nú- DOR DOR rentes primários de estruturas orofaciais e pode Bertrand N, Castro DS, Guillemot F. Proneural genes and the specification
of neural cell types. Nat Rev Neurosci 2002;3(7):517-30.
de heparina, 1X solução de Denhardt, 0,1% (p/ cleo trigeminal (Fig. 3c), estruturas identificadas ser comparado ao corno dorsal da medula Caspary T, Anderson KV. Patterning cell types in the dorsal spinal cord:
v) Tween 20, 0,1% (p/v) CHAPS e 5 mM EDTA) através da coloração por formol-tionina (Fig. 3d). 7 8 espinal. De facto, os aferentes nociceptivos what the mouse mutants says. Nat Rev Neurosci 2003;4:289-97.