Page 38 Volume 12, Número 4, 2004

A. Charrua, et al.: Caracterização do Novo Composto Iodoresiniferatoxina (IRTX)...
(Porto, Portugal), tendo-se efectuado todos os perimental (n = 5). Após um período de 30 min
esforços para minimizar a dor, o sofrimento e o para estabilização, em todas as análises, o
número de animais utilizados. Para tal, foram veículo das soluções em estudo foi aplicado to-
respeitadas todas as directivas éticas para a picamente, previamente à aplicação de cada
investigação da dor experimental em animais uma das referidas soluções. Todas as aplicações
conscientes (Zimmermann, 1983) e os métodos ocorreram num intervalo de 10 min. Assim, no
aplicados estão de acordo com a Directiva da primeiro grupo aplicou-se solução de CAP 1 µM,
Comunidade Europeia de 24 de Novembro de no segundo CAP 1 µM + CPZ 50 µM, no tercei-
1986 (86/609/EEC). Todas as manipulações ani- ro CAP 1 µM + IRTX 10 nM e no quarto grupo
mais não terminais foram efectuadas sob anes- CAP 1 µM + IRTX 10 µM.
tesia com isofluorano (4% para indução e 2% Para se comparar o efeito da dessensibiliza-
para manutenção), enquanto que as análises ção do TRPV1 induzida por RTX e IRTX, noutros
cistométricas foram efectuadas sob anestesia dois grupos experimentais (n = 5 animais/grupo
com uretano (1,2 mg/kg s.c.). experimental), foram aplicadas, respectivamen-
te, soluções de IRTX 10 µM e RTX 10 nM, por
Químicos via intravesical, durante 30 min. Para eliminar
A capsaicina (CAP), resiniferatoxina (RTX) e o quaisquer remanescentes de IRTX ou RTX, a
uretano foram adquiridos à Sigma (Portugal). A bexiga foi lavada com soro fisiológico. Vinte e
capzazepina (CPZ) e a iodoresiniferatoxina (IRTX) quatro horas depois deste tratamento, efectua-
foram adquiridas à Tocris (UK). O anticorpo anti- ram-se análises cistométricas, onde soluções
CGRP feito em coelho foi comprado à Amersham de CAP 1 µM foram aplicadas topicamente en-
(Portugal). O Kit Vectastain ABC Elite foi compra- quanto que a variação da actividade reflexa da
do à Vector (UK). O isofluorano foi fornecido pela bexiga era monitorizada e registada.
Abbott (Portugal). Para se verificar qual o efeito do tratamento por
As soluções experimentais de CAP e de RTX IRTX no conteúdo em neurotransmissores, em
foram obtidas por diluição de soluções stock dois grupos de fêmeas Wistar adultas, instilou-se
de 10 mM e 10 µM, respectivamente, em 1% de soro fisiológico (n = 2) e IRTX 10 µM (n = 2), du-
etanol em soro fisiológico (solução veículo). As rante 30 min, respectivamente. Vinte e quatro ho-
soluções experimentais de CPZ e a IRTX foram ras após este procedimento, os animais foram
obtidas por diluição da solução stock de 10 mM sacrificados por decapitação e as bexigas colhi-
e 1 mM, respectivamente, em soro fisiológico. das e fixadas em 4% paraformaldeído em 0,1 M
tampão fosfato, pH 7,4. Após seis horas de fixa-
Análise cistométrica ção, as bexigas foram colocadas em sacarose a
A bexiga foi exposta através de uma incisão 30% em tampão fosfatos 0,1 M, durante 24 h,
seguidamente foram cortadas a 20 µm num mi-
abdominal e uma agulha de calibre 21 foi inserida crótomo de congelação. Um em cada três cortes
na cúpula da bexiga. A temperatura corporal foi não consecutivos foi armazenado a –20 C. Quan-
o
mantida a 36-37 °C e controlada continuamente do todas as experiências foram concluídas, todos
por um termómetro rectal. A pressão intravesical os cortes foram lavados com PBS 0,1 M, e incu-
foi monitorizada por um transdutor de pressão badas no mesmo banho com anticorpo policlonal
(Gould Instruments) e a sua variação registada contra CGRP a 1:20.000, feito em coelho. A reac-
num computador, enquanto que solução salina foi ção imune foi visualizada pelo método de avidina-
infundida a 6 ml/h, mantendo a uretra aberta. biotina (ABC). A presença de fibras imunocoradas

Efeito da IRTX no reflexo miccional foi estudada num microscópio óptico.
Para estudar o efeito da IRTX na contracção Análise estatística
vesical, efectuaram-se análises cistométricas
(n = 5). Após um período de estabilização de As diferenças estatísticas entre os grupos ex-
30 min, soro fisiológico e soluções de IRTX perimentais foram analisadas com software Sig-
de 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 µM, 5 µM maStat 2.03 (SPSS Inc, EUA), usando o teste
e 10 µM foram aplicadas topicamente na bexi- one-way ANOVA seguida pelo teste post-hoc
ga, consecutivamente, a intervalos de 10 min. Student-Newman-Keuls para comparações múl-
Para estudar se o efeito da IRTX, na frequên- tiplas. Valores a partir de p < 0,05 foram consi-
cia urinária, é mediado pelo TRPV1 foi efectuada derados estatisticamente significativos. Os resul-
análise cistométrica (n = 5 animais/grupo ex- tados são apresentados como média ± erro
perimental). Após um período de 30 min para padrão da média.
estabilização, num dos grupos foram aplicados,
topicamente na bexiga, soro fisiológico e solução Resultados
de IRTX 50 nM, a intervalos de 10 min. Noutro A aplicação de 10 nM IRTX não alterou o nú-
grupo, aplicaram-se, do mesmo modo, soro fi- mero de contracções vesicais por minuto. No en-
siológico e 50 µM CPZ + 50 nM IRTX. tanto, a aplicação de soluções de IRTX desde DOR
Para se comparar o efeito de IRTX e CAP nas 50 nM até 10 µM fez aumentar a frequência uri-
contracções vesicais, formou-se outro grupo ex- nária (Fig. 1A). 37