Page 22 Volume 12, Número 4, 2004

C.D. Cruz, et al.: A Estimulação Mecânica de Articulações Monoartríticas Induz Fosforilação das ERKs 1 e 2 na Medula Espinhal
em neurónios no sistema nervoso central (CNS) Estimulação mecânica
adulto (Derkinderen, et al., 1999) e medeiam a No dia da experiência, os ratos controlo (C),
transdução de sinais intracelulares em resposta bem como os animais com dois (2 d MA), quatro
a uma variedade de estímulos. Após a sua acti- (4 d MA), sete (7 d MA) e catorze (14 d MA) dias
vação por fosforilação, as ERKs conseguem de monoartrite foram anestesiados com pento-
translocar-se para o núcleo, activar factores de barbital de sódio (50 mg/kg i.p.). De seguida,
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transcrição tais como o Elk-1 ou o CREB (Chang o tornozelo esquerdo foi estimulado mecanica-
e Karin, 2001), e, assim, modular a expressão mente (E, n = 6 por grupo experimental) através
génica. da flexão e extensão repetida da articulação du-
Trabalhos recentes sugeriram um possível en- rante 5 min, ou não estimulado (NE, n = 6 por
volvimento das ERKs no processamento da dor grupo experimental).
somática e visceral ao nível da medula espinhal.
No rato, as ERKs são activadas rapidamente em
neurónios da medula espinhal após estímulação Preparação do tecido e imunocitoquímica
periférica nóxica aguda, induzida por vários ti- Todos os animais foram perfundidos através
pos de estímulos (Ji, et al., 1999; Karim, et al., do ramo ascendente da aorta com 250 ml de
2001; Galán, et al., 2002; Pezet, et al., 2002; solução Tyrode fria sem cálcio e oxigenada se-
Galán, et al., 2003). Além disso, o uso de inibi- guido de 750 ml de paraformaldeído a 4% com
dores específicos da fosforilação, o PD98059 14% de ácido pícrico saturado. As medulas es-
([2-(2’-amino-3’-metoxifenil)-oxanaftaleno-4- pinhais foram removidas e pós-fixadas no mes-
ona]) e o U0126 (1,4-diamino-2,3-diciano-1,4- mo fixador durante 4 h, sendo, de seguida, guar-
bis[2-aminofeniltio]butadieno), indica que as dadas em crioprotector durante 24 h (sacarose
ERKs desempenham um papel importante nos a 30% com azida sódica 0,1% em tampão fos-
mecanismos de hiperalgesia e alodinia (Ji, et al., fato 0,1 M). Seguidamente, a porção caudal dos
1999; Ji, et al., 2002;Galán, et al., 2002; Galán, segmentos L3 e os segmentos L4 e L5 da me-
et al., 2003). dula espinhal (Grant, 1995) foram dissecados.
No presente trabalho, ratos monoartríticos a Fatias transversais com 40 µm de espessura
diferentes tempos de evolução da doença foram foram obtidas das amostras da medula espinhal,
utilizados após estimulação do tornozelo infla- utilizando um micrótomo de congelação e foram
mado, de modo a avaliar a activação das ERKs armazenados a –20 °C em solução de criopro-
em neurónios da medula espinhal. Além disso, tector até serem utilizados (Lu e Haber, 1992).
utilizámos o PD98059, um inibidor da fosforila- Após descongelação, uma em cada quatro
ção das ERKs, de modo a modular a sua activi- fatias de medula espinhal foi imunorreagido com
dade e determinar os seus efeitos no comporta- o anticorpo anti-pERKs. Resumidamente, as fatias
mento reactivo à dor nestes animais. foram lavadas em tampão fosfato salino (PBS) e
a actividade da peroxidase endógena foi inibida,
Material e métodos recorrendo-se a uma incubação com PBS com
peróxido de hidrogénio 0,3%, durante 30 min.
Após duas lavagens em PBS e uma lavagem em
Indução da inflamação crónica PBS com Triton X-100 0,3% (PBST), as fatias
Todos os ensaios foram efectuados em ratos foram incubadas, durante 1 h, com a solução de
Wistar machos adultos (colónia do IBMC, Porto, bloqueio (glicina 0,15 mM e 10% de soro normal
Portugal) com peso aproximado entre os 200 e de suíno, NSS, em PBST). De seguida, as fatias
os 300 g. Os animais foram mantidos com aces- foram incubadas com anticorpo específico para
so ad libitum a comida e água e em condições anti-pERKs (feito em coelho; New England Bio-
controladas de luz (ciclo de 12 h luz/12 h escu- labs, UK) numa diluição de 1:1.000, durante 48 h
ro) e temperatura (22 °C). Todos os métodos a 4 °C. As fatias foram então lavadas 3 vezes
utilizados estão de acordo com a Directiva da com uma solução de PBST com 2% de NSS,
Comunidade Europeia de 24 de Novembro de sendo, de seguida, incubadas durante 1 h com
1986 (86/609/EEC) e com as directivas éticas anticorpo biotinilado de suíno anticoelho (1:200;
para a investigação da dor experimental em ani- Dakopatts, Dako A/5, Copenhaga, Dinamarca).
mais (Zimmermann, 1983). De seguida, as fatias foram lavadas com PBST
A monoartrite foi induzida através da injecção e incubadas durante 1 h num complexo de avi-
de 50 µl de adjuvante completo de Freund (CFA, dina-biotina (ABC, 1:200; Vector Laboratories,
Difco Laboratories, Michigan, USA) na articulação Peterborough, UK). A visualização foi consegui-
tibiotársica esquerda do animal, sob anestesia de da com o recurso à reacção da 3,3’-diaminoben-
isofluorano (5% para indução, 2,5% para manu- zidina tetrahidrocloreto (DAB) (5 min em tampão
tenção), de acordo com Butler, et al., 1992. Tris 0,05 M com DAB a 0,05 e 0,003% de peró-
Os animais controlo foram injectados com 50 µl xido de hidrogénio). As fatias foram então mon-
de soro fisiológico e mantidos durante 2 dias. Du- tadas em lâminas de vidro revestidas com gela-
rante o curso da monoartrite, o grau de inflamação tina, desidratadas em xilol e cobertas com Eukitt. DOR
foi observado e avaliado de acordo com a escala Os anticorpos foram diluídos em PBST com 2%
proposta por Castro-Lopes, et al., 1992. de NSS e o complexo ABC foi diluído em PBST. 21