Page 15 Volume 20 - N2 - 2012

Dor (2012) 20
foram mantidos em gaiolas (2-3 por gaiola) com cerca de 250 ml de solução oxigenada Tyrode,
alimento e água, a uma temperatura constante seguida de 750 a 1.000 ml de fixador (parafor-
de 22 C e luminosidade controlada (ciclos 12 h maldeído a 4% em 0,1M de tampão fostato sa-
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luz/12 h escuridão). Todas as experiências foram lino [PBS]). Após perfusão, dissecou-se os DRG
efectuadas tendo em consideração as normas es- ipsi e contralaterais correspondendo aos seg-

tabelecidas nos regulamentos das autoridades lo- mentos espinhais L , L e L . O material biológi-
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cais relativas ao manuseamento dos animais, as- co foi pós-fixado na solução de fixador durante © Permanyer Portugal 2012
sim como as boas práticas éticas recomendadas 4 h e depois foi armazenado a 4 C em solução
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para o estudo da dor experimental em animais de sacarose 30% em tampão fosfato 0,1M. Os
e a directiva 86/609/EEC do Conselho da Comu- gânglios foram posteriormente envolvidos num
nidade Europeia revista a 22 de Julho de 2003 material congelante (Frozen Section Medium –
pela directiva 2003/65/CE. Richard-Allas Scientific) e seccionados num cri-
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A MA foi induzida por injecção de 50 µl de CFA óstato (a –20 C) em cortes sequenciais de 14 µm.
na articulação tibiotársica esquerda, tal como Este material foi recolhido em lâminas de poli-L-
descrito em Butler, et al. , sob o efeito de breve lisina, e foi armazenado a –20 C até ao início
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anestesia com isoflurano volátil (5% para indu- das reacções de imunocitoquímica.
ção e 2,5% para manutenção). O CFA foi prepa- Lâminas contendo um em cada cinco cortes
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rado como anteriormente descrito . Os ratos dos gânglios L , L e L , de cada animal em cada
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monoartríticos, mediante o grupo experimental a grupo experimental, foram processadas para a
que pertenciam, foram sacrificados 2, 4, 7 ou 14 reacção de imunofluorescência contra ATF-3.
dias após a injecção de CFA (dias de MA). O Para a tripla imunorreacção contra ATF-3, CGRP
material biológico foi recolhido a estes tempos e IB4 apenas cortes de gânglios L (um em cada
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de MA de modo a avaliar a expressão de ATF-3 cinco) foram processados. Depois de várias la-
ao longo do tempo de progressão da doença. Os vagens em PBS e um bloqueio no soro do animal
controlos foram injectados com 50 µl de veículo mais adequado, os cortes foram incubados com
de CFA (composto pelos mesmos reagentes que os anticorpos primários respectivos durante 48 h
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o CFA, excepto que não tem Mycobacterium bu- a uma temperatura de 4 C. No segundo dia de
tyricum, agente indutor da inflamação) e sacrifica- reacção e após novas lavagens em tampão, os
dos dois dias após a injecção. Resultados preli- mesmos cortes foram incubados durante 1 h nos
minares não mostram diferenças para controlos anticorpos secundários apropriados.
sacrificados a tempos posteriores após a injec- Na imunodetecção do ATF-3, os cortes dos
ção de veículo. De modo a evitar alguns com- gânglios L , L e L tanto ipsi como contralaterais
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portamentos derivados ao medo/stress, todos os (n = 5 ratos por grupo experimental) foram incu-
animais foram habituados ao experimentador, bados em anticorpo policlonal contra ATF-3 cria-
durante alguns dias, antes da injecção e duran- do em coelho (polyclonal rabbit anti-ATF-3; C-19:
te a progressão da MA. sc-188, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) numa
A evolução da reacção inflamatória foi moni- concentração de 1:500. A detecção foi feita com
torizada diariamente segundo uma escala sub- anticorpo secundário contra proteínas de coelho Sem o consentimento prévio por escrito do editor, não se pode reproduzir nem fotocopiar nenhuma parte desta publicação.
jectiva de 0 a 4 descrita por Castro-Lopes, et criado em cabra e que emite fluorescência ver-
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al. , que tem em consideração os sinais infla- melha por estimulação com luz de comprimento
matórios e a redução da actividade locomotora de onda adequada (Alexa 594 goat-anti-rabbit;
e em que: 0 corresponde a uma ausência de si- A11012, Molecular Probes, Estados Unidos da
nais inflamatórios; 1 indica alterações mínimas de América [EUA]) numa concentração de 1:1.000.
inchaço e rubor; 2 representa inchaço mais inten- Na tripla imunodetecção do ATF-3, CGRP (mar-
so e diminuição de movimentos passivos; 3 cor- cador neuronal de aferentes primários peptidér-
responde aos sintomas anteriores e ainda a uma gicos) e IB4 (marcador neuronal de aferentes
maior dificuldade em colocar peso sobre a pata primários não-peptidérgicos), os cortes de gân-
inflamada, neste caso a esquerda, e 4 que indica glios L ipsilaterais (n = 5 ratos para controlos e
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sintomas muito severos de inflamação que afec- 7 d MA; n = 4 ratos para todos os outros grupos
tam tanto a actividade motora como ocorre fle- experimentais) foram inicialmente incubados em
xão persistente do joelho. anticorpo policlonal contra ATF-3 criado em coelho
Para melhor avaliar a severidade da inflama- (polyclonal rabbit anti-ATF-3; 1:500) e em anti-
ção, medimos também o diâmetro das patas corpo contra CGRP criado em ovelha (sheep
inflamadas, fazendo uma comparação com a anti-CGRP; ab22560 ABCAM, Cambridge, Reino
respectiva pata contralateral e as patas não in- Unido) numa concentração de 1:4.000. A detec-
flamadas dos animais-controlo. ção foi feita usando o anticorpo secundário con-
tra proteínas de coelho criado em burro que
emite fluorescência verde (Alexa 488 donkey
Imuno-histoquímica anti-rabbit; A21206, Molecular Probes, EUA) numa
Cada rato foi anestesiado por injecção intra- concentração de 1:1.000, no caso do ATF-3, e o
DOR peritoneal com hidrato de cloral 35% (p/v em anticorpo secundário contra proteínas de ovelha
criado em burro que emite fluorescência ver-
soro; 0,1 ml/100 g de peso corporal). A perfusão
14 foi depois feita através da aorta ascendente com melha (Alexa 568 donkey anti-sheep; A21099,