Page 16 Volume 20 - N2 - 2012

D.S. Marques Nascimento, et al.: O Marcador de Lesão Neuronal ATF-3 é Expresso nos Neurónios Aferentes Primários de Ratos Monoartríticos
Molecular Probes, EUA) numa concentração de objectiva, intensidade de luz, contraste e tonali-
1:1.000 no caso do CGRP. As lâminas foram dade foram mantidos constantes.
posteriormente incubadas por uma noite à tem- No que diz respeito à imunodetecção do ATF-3,
peratura ambiente em IB4 da Bandeiraea simpli- todas as células IR foram contadas em cortes se-
cifolia conjugada com biotina (L2140, Sigma quenciais espaçados de 5 em 5 (14 µm × 5) de
Aldrich), numa concentração de 1:1.000. A de- cada gânglio e esse número foi dividido pelo
tecção fez-se por incubação numa solução de número total de cortes, contendo corpos celula- © Permanyer Portugal 2012
estreptavidina conjugada com uma molécula res dos neurónios aferentes primários, analisados
que emite fluorescência azul (streptavidin 350; na respectiva lâmina (aproximadamente 9-12 cor-
Jackson ImmunoRes. Lab, Inc.), numa concen- tes por DRG). A marcação do ATF-3 é nuclear e
tração de 1:200. Para comprovar a especificida- distinta, e portanto só células com núcleos per-
de da reacção, reagiram-se lâminas exactamen- feitamente visíveis foram consideradas. Para a
te como o descrito acima, excluindo o passo da tripla imunodetecção do ATF-3, CGRP e IB4,
incubação com o anticorpo primário. Depois de pelo menos um total de 350 células com núcleo
reagidas, as lâminas foram montadas com glice- visível, por rato/DRG (o que corresponde a uma
rol em PBS 0,4M para posterior visualização em média de 1.500 células por grupo experimental),
microscópio de fluorescência. foram aleatoriamente contabilizadas em cerca
de oito a nove cortes (espaçados de cinco em
Tratamento com cetoprofeno cinco) do mesmo gânglio, de modo semelhante
Para avaliar o efeito de um anti-inflamatório ao já descrito 22,28 . Dependendo do marcador, esta
não-esteróide (AINE), inibidor não selectivo da contagem corresponde a cerca de 400-750 neu-
COX (cetoprofeno), na expressão do ATF-3 e rónios imunorreactivos por grupo experimental.
CGRP, induziu-se a MA como descrito acima Assim, de forma a avaliar a expressão de ATF-3 e
e administrou-se o fármaco diariamente (5 mg/kg dos dois marcadores de população neuronal, in-
de rato/24 horas; subcutâneo). Num dos grupos dividualmente, as células IR a cada uma das três
experimentais, o cetoprofeno foi administrado moléculas foram contabilizadas e divididas pelo
logo a partir do dia em que foi injectado o CFA número total de neurónios aleatoriamente selec-
para indução da MA (dia 0), de modo a diminuir cionados. As percentagens de co-localização entre
o desenvolvimento de um ambiente neuroinflama- ATF-3 e CGRP ou ATF-3 e IB4 obtiveram-se dividin-
tório, desde o inicio. Num outro grupo experimen- do o número de células duplamente marcadas pelo
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tal, o fármaco foi administrado também diaria- número total de células positivas para ATF-3 .
mente mas apenas a partir do dia 2 após indução O mesmo tipo de selecção aleatória e cálculo de
da MA, pelo facto de sabermos que a este tem- percentagens de co-localização foi utilizado para
po de progressão da doença a expressão de o estudo da expressão de CGRP nos animais MA
ATF-3 já alcançou valores elevados nos gânglios tratados com cetoprofeno e não tratados.
L ipsilaterais à pata inflamada (resultados pré-
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vios). Um grupo controlo foi injectado diariamen- Distribuição por áreas Sem o consentimento prévio por escrito do editor, não se pode reproduzir nem fotocopiar nenhuma parte desta publicação.
te com soro fisiológico, após igual indução de As áreas de todas as células positivas para
MA na articulação tibiotársica. Todos os animais ATF-3 (n = 4 ratos para 7 d MA; n = 5 ratos para
foram perfundidos com 4 d de MA, o pico da todos os outros grupos experimentais) foram me-
expressão de ATF-3, e os gânglios L tanto ipsi didas. As áreas de neurónios peptidérgicos que
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como contralaterais foram dissecados e proces- expressaram CGRP, seleccionados aleatoriamen-
sados para imunocitoquímica contra ATF-3 (n = 4 te durante a contagem das células IR (ponto an-
ratos por grupo experimental) e CGRP (n = 5 ratos terior), foram também obtidas (n = 5 ratos para
por grupo experimental), como descrito no pon- controlos e 7 d MA; n = 4 ratos para todos os
to anterior. A severidade dos sintomas inflama- outros grupos experimentais). Para tal, as célu-
tórios foi monitorizada igualmente em todos os ani- las IR para cada marcador foram manualmente
mais usando uma escala de graus inflamatórios contornadas usando um rato de computador e
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e por medição do diâmetro das patas inflama- desta forma as áreas foram calculadas através de
das, como já descrito acima. um software de imagem de acesso livre (ImageJ
®
versão 1.37) 28,29 . Mediante a medida da sua área,
Análise de dados as células foram agrupadas em três categorias:
pequenas (< 600 µm ), médias (600-1.200 µm )
2
2
2
Contagem das células e grandes (> 1.200 µm ) como descrito anterior-
mente pelo grupo de Noguchi .
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A análise da marcação por imunocitoquímica foi
realizada por um experimentador desconhecedor
dos grupos experimentais em estudo utilizando-se Análise estatística
um microscópio de fluorescência (AXIO Imager.Z1, A análise estatística dos dados foi feita através
®
Zeiss), acoplado a uma câmara digital (Axiocam do software GraphPad Prism 5 (GraphPad Sof-
MRm) e um software de imagem (Axiovision 4.6). tware) e SPSS versão 13.0. Para todos os resul- DOR
Para se obterem as fotomicrografias, os parâme- tados, e tendo em conta o número de grupos
tros de aquisição de imagens como amplificação, experimentais, utilizamos sempre uma análise de 15