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Dor (2002) 10
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regulamentos das autoridades locais relativos ao manusea- mente descritas . Assim, essas sondas são complementa-
mento de animais de laboratório, assim como as regras para res em 45-mers com as sequências que codificam 15
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o estudo da dor experimental em animais conscientes e a aminoácidos na zona aproximadamente 100 aminoácidos
directiva 86/609/EEC da União Europeia. antes da primeira região transmembranar. As sequências
codificadas por essas sondas são QYTEANRYDYVHVGT
Indução da inflamação crónica para o mGluR1, VFNLQQTGGKYSYLK para o mGluR3,
YQYQLRNGSAEYKVI para o mGluR4, WDNGELKMDDDE-
A monoartrite foi induzida por injecção intra-articular de
50 ml de CFA na articulação tibiotársica de acordo com o VWS para o mGluR5, e YRLIGQWTDELQLNI para o mGluR7.
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método descrito por Butler , sob a acção de uma breve Injecção estereotáxica de EGLU
anestesia com halotano. Um grupo de animais controlo foi
injectado de modo semelhante com soro fisiológico. A evo- De maneira a minimizar quaisquer comportamentos moti-
lução da reacção inflamatória foi monitorizada usando uma vados pelo medo, os animais foram habituados ao investiga-
escala subjectiva que tem em consideração os sinais infla- dor durante vários dias antes da injecção de CFA e durante
matórios locais e a actividade motora do animal, onde 0 a evolução da monoartrite até os testes comportamentais
equivale a não haverem sinais inflamatórios e 4 equivale a serem realizados (14 dias após injecção de CFA). Sete dias
uma inflamação grave com repercussões sobre a actividade após a injecção de CFA, foi implantada cirurgicamente sob
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motora do animal . anestesia com halotano uma cânula-guia (Sterican, 23 gauge,
Os animais monoartríticos foram sacrificados 2, 4 e 14 0,60 mm o.d., B. Braun A.G., Alemanha) a uma distância 3-
dias após a injecção de CFA (n = 6 por grupo experimental). 5 mm dorsalmente à porção mais rostral do Rt contralateral à
articulação inflamada, de acordo com as coordenadas este-
Hibridização in situ reotáxicas de Paxinos e Watson (dorsoventral [DV]: 5,8 mm;
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lateromedial [LM]: –1,9 mm; rostro-caudal [RC]: –1,30 mm,
Os animais utilizados no estudo da distribuição da ex-
pressão do ARNm para os diferentes subtipos de mGluR relativamente ao bregma). Após fixação da cânula ao crânio
com parafusos de aço inoxidável e cimento acrílico de den-
(ratos normais, n = 4), assim como os ratos monoartríticos tista, os animais recuperaram da cirurgia durante sete dias.
e os respectivos ratos controlo (sacrificados dois dias após No dia das experiências (14 dias após injecção de CFA) os
injecção de soro fisiológico, n = 6) foram decapitados e os ratos foram injectados no Rt com 2 µl de soro fisiológico
seus encéfalos foram dissecados, imediatamente congela- (grupo controlo, n = 6) ou com 80 nmol do antagonista
dos em gelo seco e armazenados a –80 °C. Foram depois selectivo para o grupo II dos mGluR, o EGLU (Tocris Tockson,
seccionadas fatias transversais do encéfalo (14 µm de Grã-Bretanha, n = 6) dissolvido em 2 µl soro estéril, a pH 7,6.
espessura) num crióstato a –20 °C e montadas em lâminas As injecções efectuaram-se através de uma agulha de injec-
de vidro revestidas com poli-L-lisina. Os cortes foram então ção (0,30 mm o.d., Becton Dickinson, Irlanda) inserida na
fixados durante 5 min em 4% paraformaldeído a 4 °C, cânula-guia e ligada a uma seringa de Hamilton por um tubo
lavados em tampão fosfato salino (PBS) durante 2 min, de polietileno. A agulha de injecção foi descida 3-5 mm
desidratados em etanol a 70% e finalmente em etanol a 96% abaixo da extremidade da cânula-guia e as soluções foram
onde foram armazenados a 4 °C até se efectuar a hibridiza-
ção in situ. administradas durante um período de 60 s. O “teste da flexão
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do tornozelo” foi efectuado imediatamente antes da injecção
Para a hibridização in situ foi usado o método previamen-
te descrito por Tölle, et al. , e Wisden e Morris . Assim, (tempo 0) e a 15 tempos diferentes durante os 60 min que se
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sucederam à injecção (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 5, 7, 10, 12, 15,
foram usadas sondas sintéticas de oligonucleótidos marca- 20, 30, 45 e 60 min). Este teste foi realizado por um investi-
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das radioactivamente com [α- S]dATP (1.200 Ci/mmol; NEN gador desconhecedor da substância injectada, e consiste na
Dupont) por acção da terminal transferase (Boehringer Man- avaliação do número de vocalizações e/ou de reacções
nheim, Alemanha), numa razão molar de 30:1 de dATP: agressivas do animal em resposta a cinco flexões e exten-
oligonucleótido. Essas sondas foram depois diluídas a uma sões alternadas da articulação do tornozelo feitas pelo inves-
concentração de 1 pg/µl num tampão de hibridização con- tigador. A pontuação final do teste é determinada usando
tendo 50% de formamida, citrato de sódio salino (SSC) 4X uma escala de avaliação, onde os valores mais altos (2
e sulfato de dextrano (10%). Em seguida séries adjacentes pontos) são dados pelas vocalizações em resposta a manipu-
de cortes do tálamo de ratos normais, controlo e monoartrí- lações moderadas (flexões e extensões) da articulação infla-
ticos, foram hibridizados com esta solução a 42 °C durante mada e uma pontuação mais baixa é dada quando não
17 h e depois foram sequencialmente lavados com SSC 1X ocorrem respostas de nenhum tipo (0 pontos). A soma de
a 56 °C durante 30 min, seguida de passagens por SSC 1X, todas as reacções a cada flexão e extensão, com valor
SSC 0,1X e desidratação em etanol, à temperatura ambien- máximo de 20, determina a pontuação do “teste da flexão do
te. As lâminas com os cortes foram então expostas a um tornozelo”, e dá uma indicação da alodínia e da hiperalgesia.
filme Kodak XAR-5 durante 4 semanas e depois embebidas A validade deste teste na avaliação dos efeitos de compostos
numa emulsão fotográfica (NTB2 Kodak) diluída em 0.05% analgésicos, tais como morfina em doses diferentes, foi já
de glicerol em água destilada e expostas durante 8 sema- 69
nas. Os cortes foram depois revelados com o revelador D19 demonstrado em ratos monoartríticos .
Após o período experimental de 60 min, os ratos foram
(Kodak), fixados e corados com tionina, e finalmente exami- anestesiados com hidrato de cloral e foram perfundidos
nados em microscopia óptica de campo claro e escuro. A com paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 M, pH
especificidade do sinal de hibridização foi determinada por 7,4. Os encéfalos foram depois removidos e processados
incubação de cortes com um excesso de 100 vezes de para posterior avaliação histológica do local da injecção em
sonda não-marcada juntamente com a sonda marcada cor- cortes transversais com 60 µm de espessura corados com
respondente. Nessas lâminas não foi possível detectar ne- Violeta de Cresilo (Fig. 10).
nhum sinal para além dos valores do fundo (background).
No estudo da distribuição da expressão do ARNm de Análise de dados
mGluR nos ratos normais foram analisados os subtipos Para se obter uma medição quantitativa da distribuição
mGluR1, 3, 4, 5 e 7 enquanto no estudo da expressão em
DOR ratos monoartríticos foram só analisados os subtipos da expressão do ARNm para os mGluR, foram analisados

32 mGluR1, 3, 4 e 7. As sondas sintéticas de oligonucleótidos cortes transversais consecutivos e seriados do tálamo de
específicas para o ARNm de cada mGluR foram já anterior-
ratos normais hibridizados com cada um dos mGluR estuda-