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F. Lourenço Moreira Neto, J.M. Castro-Lopes: Envolvimento dos Receptores Metabotrópicos do Glutamato na Dor Crónica: Estudo Experimental
expressão diferencial dos subtipos de mGluR nesses núcle-
os em animais normais observado na primeira parte deste
trabalho. Também aqui os núcleos em questão foram anali-
sados a três níveis rostro-caudais e quando necessário duas
ou três imagens do mesmo núcleo em regiões diferentes
foram captadas e a média dos resultados foi efectuada de
modo semelhante ao anteriormente descrito mas, neste
caso, as medições foram feitas separadamente para os
lados ipsi e contralateral ao membro injectado com soro ou
CFA. A média dos valores da expressão do ARNm para os
mGluR nos lados ipsi e contralateral para cada núcleo foi
obtida adicionando e fazendo-se a média dos valores indi-
viduais medidos em cada um dos níveis rostrocaudais des-
Figura 1. Desenhos esquemáticos de secções
transversais seriadas do tálamo do rato adulto de critos, excepto no Rt onde não foi feita essa média visto
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acordo com Paxinos e Watson . Cada desenho terem sido encontradas grandes diferenças rostrocaudais
corresponde aproximadamente a um dos três diferentes nos níveis de expressão do ARNm para o mGluR3. Seguida-
níveis rostrocaudais onde foi avaliada a expressão do mente, também esses valores foram normalisados por divi-
ARNm para os vários subtipos de mGluR estudados. são pelos valores do fundo de modo semelhante ao já
descrito. Os valores médios de expressão do ARNm para
cada mGluR em cada grupo experimental foram obtidos
fazendo a média dos valores individuais normalisados. No
dos. Para cada animal foram analisados 20 núcleos talâmi- grupo controlo, foi feita a média dos valores obtidos nos
cos nos dois lados dos cortes de encéfalo onde podiam ser lados ipsi e contralateral uma vez que não foram encontra-
anatomicamente identificados. A delimitação de cada área das diferenças estatísticas entre os valores dos dois lados
analisada (Fig. 1) foi feita de acordo com o Atlas do (teste t de Student). Os valores da densidade de grãos de
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Encéfalo de Rato de Paxinos e Watson em cortes que prata estão apresentados em tabelas sob a forma de média
foram imersos em emulsão fotográfica e corados com tioni- ± SEM do número de vezes acima dos valores do fundo a
na. Quando possível, cada um dos núcleos talâmicos estu- que um certo RNAm se encontra expresso, e tal como
dados foi analisado a três diferentes níveis rostrocaudais anteriormente os valores de densidade de grãos inferiores a
(Fig. 1) correspondendo a valores interaurais compreendi- 1,5x foram considerados como sendo valores do fundo.
dos entre 4,84 e 5,20 mm para o primeiro nível, 6,20 e 6,44 Para comparar a expressão do ARNm para cada mGluR em
mm para o segundo, e 7,20 e 7,60 para o terceiro nível, de cada núcleo talâmico dos ratos controlo ou dos ratos com 2,
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acordo com Paxinos e Watson . 4 ou 14 dias de monoartrite, foi efectuada uma análise de
Para cada animal, cada núcleo e cada subtipo de mGluR variância (ANOVA) para cada núcleo analisado, seguida do
em estudo, foram feitas medições bilaterais da razão entre teste posthoc de Duncan.
a área total ocupada pelos grãos de prata localizados sobre Relativamente ao estudo do efeito da injecção de um
células neuroniasis (e gliais no caso do mGluR3) e a área antagonista do grupo II dos mGluR, as pontuações indivi-
total ocupada por essas células (área de grãos/área de duais do “teste da flexão do tornozelo” dos animais controlo
células), usando um sistema de captação e análise de e dos ratos injectados com EGLU foram comparadas esta-
imagem computadorizado (Optimas Bioscan) e acoplado a tisticamente através de uma análise de variância (ANOVA)
um microscópio óptico (Leica axioplan) e a uma câmara de com uma análise de observações repetidas. Os resultados
vídeo (Sony Hyper HAD Digital Colour). Quando o núcleo apresentados representam as pontuações do teste (média ±
seleccionado era demasiado grande para o tamanho da SEM) para os grupos controlo e injectado com EGLU a cada
imagem captada pela câmara (região de interesse), foram tempo avaliado (Fig. 9).
adquiridas duas ou três imagens do mesmo núcleo em
diferentes regiões, que foram posteriormente analisadas, e Resultados
foi calculada a média dos resultados. Assim, para cada
núcleo e cada mGluR foram primeiro obtidos valores médios Distribuição do ARNm para os mGluR no tálamo
fazendo-se a média de todos os valores de medição indivi- de ratos normais
duais para os lados direito e esquerdo em cada um dos
níveis rostrocaudais, para os diferentes ratos. Para normali- A expressão do ARNm para o mGluR1, 3, 4, 5 e 7 foi
zação, cada um desses valores médios foi depois dividido investigada no tálamo a três níveis rostrocaudais diferentes.
pelos valores do fundo, que foram determinados de modo Os resultados para os diversos núcleos talâmicos estão
semelhante aos outros valores, mas no neurópilo onde, sumariados nas tabelas 1 e 2. Para que se consiga uma
muito provavelmente, não ocorreu marcação específica. Os melhor correlação entre os resultados e as diferentes re-
números finais obtidos, que representam os valores de giões anatómicas, apresentam-se na figura 1 diagramas
expressão do ARNm específica para cada subtipo e para esquemáticos de cortes seriados do tálamo.
cada região analisada, equivalem a uma densidade de Em geral, os grãos de prata concentraram-se em corpos
grãos de prata e são apresentados como a média ± desvio celulares com características citológicas de neurónios (Fig.
padrão da média (SEM) do número de vezes acima dos 2a), com a excepção da sonda para o mGluR3 que também
valores do fundo a que um certo RNAm se encontra expres- marcou presumíveis células gliais (Fig. 2c).
so. Os valores de densidade de grãos inferiores a 1,5 vezes Cada um dos subtipos de mGluR investigado, mesmo
os valores do fundo foram considerados como sendo iguais quando pertencentes ao mesmo grupo (grupo I: mGluR1 e 5;
aos valores do fundo. grupo III: mGluR 4, e 7) apresentaram um padrão de expres-
Nos animais controlo e monoartríticos, somente seis nú- são do ARNm diferencial nos diferentes núcleos talâmicos
cleos do tálamo, incluindo o VPL, VPM, Po, Sub, Pf e Rt, (Tabelas 1 e 2). A expressão mais pronunciada foi encontrada
foram seleccionados para análise quantitativa da expressão para o transcripto do mGluR4, sendo amplamente distribuída
do ARNm para o mGluR1, 4 e 7 (nas cinco primeiras por todo o tálamo excepto no Rt, no qual também não se DOR
regiões) e para o mGluR3 (no Rt), tendo em conta o seu encontra praticamente nenhuma marcação específica para o
reconhecido envolvimento na nocicepção e o padrão de mGluR1, 5 e 7. Em contraste, o sinal para o mGluR3 encon- 33